Fenbendazol wirkt als moderater Mikrotubuli-Destabilisator und verursacht den Tod von Krebszellen durch Modulation mehrerer zellulärer Signalwege

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Die Studie ist eingegangen: 26. April 2018 und angenommen: 16. Juli 2018.
Online veröffentlicht: 09. August 2018

Nilambra Dogra1,2, Ashok Kumar1,3 & Tapas Mukhopadhyay1

1 – Nationales Zentrum für Humangenomstudien und -forschung, Panjab University, Sector-14, Chandigarh, 160014, Indien. 2 – Derzeitige Adresse: Abteilung für experimentelle Medizin und Biotechnologie, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Sector-12, Chandigarh, 160012, Indien. 3 – Gegenwärtige Adresse: Zentrum für Systembiologie und Bioinformatik, Panjab-Universität, Sektor-25, Chandigarh, 160014, Indien. Korrespondenz und Materialanfragen richten Sie bitte an T.M. (E-Mail: [email protected])

Medikamente, die bereits klinisch zugelassen sind oder experimentell für andere Krankheiten als Krebs getestet wurden, aber eine bisher nicht erkannte Zytotoxizität gegenüber bösartigen Zellen aufweisen, können als geeignete Kandidaten für die Krebsbekämpfung dienen. Methyl-N-(6-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl)-carbamat [Fenbendazol, FZ], eine Benzimidazolverbindung, ist ein sicheres und kostengünstiges Anthelminthikum mit einer effizienten proliferationshemmenden Wirkung.

In unserer früheren Arbeit berichteten wir über eine starke wachstumshemmende Wirkung von FZ, die teilweise durch eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion verursacht wird. Hier zeigen wir, dass FZ eine mäßige Affinität zu Säugetier-Tubulin aufweist und in mikromolaren Konzentrationen Zytotoxizität auf menschliche Krebszellen ausübt. Gleichzeitig verursachte es eine mitochondriale Translokation von p53 und hemmte wirksam die Glukoseaufnahme, die Expression von GLUT-Transportern sowie die Hexokinase (HK II) – ein wichtiges glykolytisches Enzym, von dem die meisten Krebszellen leben. Es blockierte das Wachstum menschlicher Xenotransplantate im nu/nu-Mäusemodell, wenn die Mäuse das Medikament oral erhielten.

Die Ergebnisse deuten in Verbindung mit unseren früheren Daten darauf hin, dass FZ ein neuer Mikrotubuli-interferierender Wirkstoff ist, der eine antineoplastische Aktivität aufweist und aufgrund seiner Wirkung auf mehrere zelluläre Wege, die zu einer effektiven Beseitigung von Krebszellen führen, als potenzielles therapeutisches Mittel bewertet werden kann.

Die Bedeutung der Mikrotubuli für die Zellteilung, die Motilität, den intrazellulären Transport und ihre Rolle bei der Anpassung der Zellform an die Umgebung haben sie zu einem der erfolgreichsten Ziele der Krebstherapie gemacht. Wirkstoffe, die die Mikrotubuli-Dynamik stören, werden in der Krebsbehandlung häufig eingesetzt1-4. In Anbetracht des relativen Erfolgs mitotischer Wirkstoffe bei der Behandlung von Krebs können Mikrotubuli als eines der besten bisher identifizierten Krebsziele bezeichnet werden5.

Wirkstoffe, die auf Mikrotubuli abzielen, lassen sich grob in zwei Hauptklassen einteilen. Die erste Klasse besteht aus Mikrotubuli-destabilisierenden Wirkstoffen, die die Polymerisation der Mikrotubuli hemmen. Zu dieser Klasse von antimitotischen Wirkstoffen gehören mehrere Verbindungen wie die Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin, Vinorelbin, Vinflunin), Estramustin, Colchicin und Combretastatine, die bereits klinisch eingesetzt werden oder für die Krebsbehandlung in der klinischen Prüfung sind. Die zweite Klasse besteht aus Mitteln, die die Mikrotubuli stabilisieren. Zu diesen Wirkstoffen gehören Paclitaxel, Docetaxel, Epothilone und Discodermolid6.
Die Störung der Tubulin- und Mikrotubuli-Dynamik durch diese beiden Wirkstoffklassen in sich teilenden Zellen führt zum Metaphasenstillstand und zur Auslösung der Apoptose.

Fenbendazol (Methyl-N-(6-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl)-carbamat) ist ein Benzimidazol-Anthelminthikum mit breitem Wirkungsspektrum, das für die Anwendung bei zahlreichen Tierarten zugelassen ist7. Die Umwidmung von Tierarzneimitteln, die vielversprechende Ergebnisse zeigen, für die Verwendung beim Menschen kann zu einer erheblichen Zeit- und Kostenersparnis bei der Entwicklung neuer Arzneimittel führen. Fenbendazol hat bekanntermaßen eine hohe Sicherheitsspanne und wird von den meisten Tierarten sehr gut vertragen. Es weist eine sehr geringe Toxizität und ein hohes Maß an Sicherheit bei Versuchstieren auf8-12.

In dieser Studie zeigen wir, dass Fenbendazol FZ) eine mäßige Mikrotubuli depolymerisierende Aktivität gegenüber menschlichen Krebszellen aufweist, aber eine starke Antitumorwirkung besitzt, wie aus In-vitro- und In-vivo-Versuchen hervorgeht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass FZ seine antitumorale Wirkung durch die Störung der Mikrotubuli-Dynamik, die Aktivierung von p53 und die Modulation von Genen, die an mehreren zellulären Signalwegen beteiligt sind, entfaltet. Die Behandlung mit FZ führte auch zu einer verringerten Glukoseaufnahme in den Krebszellen, was auf eine Herunterregulierung der GLUT-Transporter und wichtiger glykolytischer Enzyme zurückzuführen ist.

Da am Prozess der Tumorentstehung eine Reihe von Genen und Proteinen beteiligt sind, die verschiedene Zellsignalwege verändern, zeigen Medikamente, die nur auf ein einziges Ziel ausgerichtet sind, nur eine begrenzte Wirksamkeit und können zu Arzneimittelresistenz führen13-15. Von Wirkstoffen, die auf mehrere zelluläre Ziele abzielen, erwartet man daher nicht nur eine bessere Wirksamkeit, sondern auch die Möglichkeit, die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung zu umgehen. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit eine pleiotrope Wirkung von FZ auf Krebszellen, die zum Zelltod führt. Somit könnte FZ eine potenzielle therapeutische Anwendung haben.

Ergebnisse
FZ destabilisiert das Tubulin-Netzwerk in menschlichen NSCLC-Zellen.

Es wurde berichtet, dass Benzimidazolcarbamate die Tubulinpolymerisation hemmen und die Mikrotubuli-Funktion in Parasitenzellen stören16,17. Ergebnisse von In-vitro-Studien mit angereicherten Extrakten von Helminthen- und Säugetier-Tubulin legen nahe, dass Tubulin das primäre molekulare Ziel der Benzimidazole ist18.

Um die Wirkung von FZ auf die Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks von Säugetieren zu untersuchen, wurden A549-Zellen des menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) 24 Stunden lang mit 1 uM FZ behandelt und für die Immunfluoreszenz mit einem α-Tubulin-Antikörper bearbeitet. Colchicin wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die FZ-Behandlung eine teilweise Veränderung des Mikrotubuli-Netzwerks verursachte (Abb. 1a). Der Mikrotubularkäfig um den Zellkern schien im Vergleich zu den mit Mock behandelten Kontrollzellen seine Intaktheit verloren zu haben. Diese Veränderung in der Organisation war jedoch nicht so ausgeprägt wie bei der Behandlung mit Colchicin, bei der eine vollständige Depolymerisation der Mikrotubuli in Tubulin-Untereinheiten festgestellt wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass FZ ein verzerrtes Mikrotubuli-Gerüst in den Zellen verursacht.

Die Wirkung von FZ auf die Tubulinpolymerisation wurde mit einem In-vitro-Assay weiter untersucht. Gereinigtes Rindertubulin wurde mit FZ inkubiert, und die Tubulinpolymerisation wurde im Laufe der Zeit aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigten eine leichte Hemmung der Tubulinpolymerisation durch FZ in vitro, die nicht so ausgeprägt war wie bei der Behandlung mit Colchicin. (Abb. 1b)

Anschließend wurde die Wirkung von FZ auf die Tubulinpolymerisation mit der Wirkung anderer Mikrotubuli-Destabilisatoren wie Nocodazol und Colchicin verglichen. Polymerisierte und lösliche Fraktionen wurden nach 24-stündiger Behandlung mit dem Wirkstoff hergestellt und ein Western Blot mit α-Tubulin- und β-Actin-Antikörpern durchgeführt (Abb. 1c). Die Tubulinbanden der polymerisierten und löslichen Fraktionen wurden nach Normalisierung mit ihren jeweiligen β-Actin-Banden quantifiziert, die als interne Kontrolle dienten (Abb. 1d).

In den mit FZ behandelten Zellen war eine leichte Abnahme des polymeren Tubulins im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen festzustellen, während die polymerisierte Form des Tubulins in den mit Colchicin behandelten Zellen fast nicht vorhanden war. Das Ergebnis bestätigt die relativ milde Tubulin-depolymerisierende Aktivität von FZ im Vergleich zu anderen bekannten Mikrotubuli-Auflösern wie Nocodazol und Colchicin.

Ein wichtiger einschränkender Faktor von Taxanen und Vinca-Alkaloiden ist ihre dosisbegrenzende Toxizität und ihre Anfälligkeit für eine Multidrug-Drug-Resistenz (MDR), die in der Regel auf die hohe Expression von p-Glykoprotein (p-gp; MDR1) zurückzuführen ist19,20. Eine Überexpression von β-Tubulin-Isoformen und Mutationen sind ebenfalls dafür bekannt, dass sie eine Resistenz gegen Taxane verleihen21.

Im Gegensatz zu Taxanen und Vinca-Alkaloiden sind Wirkstoffe, die auf die Colchicin-Bindungsstelle abzielen, insofern vorteilhaft, als sie zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, die Wirkung der Überexpression von β-Tubulin-Isoformen zu überwinden, eine minimale Multidrug-Resistenz aufweisen22-24. Der größte Nachteil von Colchicin und seinen Derivaten ist jedoch ihre akute Toxizität für den Menschen22,25. Daher kann ein Mikrotubuli-Inhibitor, der an die Colchicin-Bindungsstelle bindet, aber eine geringe Toxizität aufweist, hochwirksam sein26,27. Das Ergebnis eines fluoreszenzbasierten kompetitiven Colchicin-Bindungstests deutet darauf hin, dass FZ an der Colchicin-Bindungsstelle an das Tubulin binden kann (Abb. S1).

Die Acetylierung von Tubulin wird mit der Stabilität von Mikrotubuli in Verbindung gebracht. Um den Acetylierungsstatus von Tubulin nach der Behandlung zu untersuchen, wurden menschliche NSCLC-Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Mikrotubuli-Targeting-Agenten behandelt, und die Zellextrakte wurden einer Western-Blot-Analyse mit dem spezifischen Ac-α-Tubulin-Antikörper (6-11B-1) unterzogen. Wie in Abb. 1e gezeigt, führten Nocodazol, Colchicin und Vincristin zu einer deutlichen Verringerung des acetylierten Tubulins, während FZ die Menge des acetylierten Tubulins im Vergleich zu den mit Mock behandelten Kontrollzellen nicht veränderte. Dieses Ergebnis bestätigt die relativ milde Wirkung von FZ auf Säugetier-Tubulin im Vergleich zu anderen bekannten Mikrotubuli-Depolymerisationsmitteln.

Abbildung 1. Die FZ-Behandlung verändert das Tubulin-Netzwerk menschlicher Krebszellen. (a) A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 1 uM FZ oder 50 ng/ml Colchicin behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen für die Immunfluoreszenz mit primären Anti-α-Tubulin- und FITC-konjugierten sekundären Antikörpern bearbeitet. (Die Zellkerne wurden mit Propidiumjodid gegengefärbt). (b) Rindertubulin (1,8 mg/mL) wurde mit DMSO (Kontrolle), FZ (10 uM) oder Colchicin (100 nM) inkubiert und die Wirkung auf die Polymerisation wurde spektrophotometrisch durch Messung der Trübung bei 340 nm wie unter „Methoden“ beschrieben überwacht. (c) Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit FZ, Nocodazol, Taxol oder Colchicin behandelt und anschließend lysiert und in lösliche (S) und polymerisierte (P) Extrakte fraktioniert. Die Extrakte wurden mit SDS-PAGE getrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und mit Anti-α-Tubulin- und Anti-β-Actin-Antikörpern untersucht. Abgebildet ist eine repräsentative Immunoblot-Analyse in A549-Zellen. (d) Die Intensität jeder Bande des Immunoblots wurde mit dem NIH-Programm ImageJ gemessen, und die Verhältnisse von löslichem und polymerisiertem Tubulin und β-Actin bei jeder Behandlung wurden berechnet. (e) Die Zellen wurden wie angegeben 24 Stunden lang mit verschiedenen MTAs behandelt und anschließend wurde ein Western Blotting mit Ac-α-Tubulin (6-11B-1) spezifischen und β-Actin-Antikörpern durchgeführt. (Unbeschnittene Blots in voller Länge sind in der ergänzenden Abb. S6 enthalten).

FZ ist weder ein P-gp-Substrat noch ein Inhibitor.

Die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen ist ein großes Problem bei der Krebsbehandlung. Die Multidrug-Resistenz (MDR), die durch die Überexpression des MDR-1-Gens verursacht wird, das für das P-Glykoprotein (P-gp) kodiert, ist ein entscheidender Mechanismus der Arzneimittelresistenz, der zu einer Kreuzresistenz gegenüber mehreren Arzneimittelklassen führt28,29.

Zahlreiche häufig verwendete Chemotherapeutika wie Taxane und Vinca-Alkaloide sind P-gp-Substrate30.

Die Bemühungen, P-gp zu hemmen, haben jedoch aufgrund unvermeidlicher Nebenwirkungen keine ermutigenden Ergebnisse gezeigt31,32. Daher ist die Entdeckung und Entwicklung neuer proliferationshemmender Verbindungen, die keine P-gp-Substrate sind, ein wirksamer Ansatz zur Überwindung der Arzneimittelresistenz. Um zu testen, ob FZ ein Substrat oder ein Inhibitor von P-gp ist, untersuchten wir die Wachstumshemmung von Krebszellen durch FZ in Gegenwart des P-gp-Inhibitors Verapamil. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung von P-gp durch Verapamil die hemmende Wirkung von FZ auf die Proliferation von Krebszellen nicht verstärkte (Abb. 2c). Der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 (Rho123) ist ein bekanntes P-gp-Referenzsubstrat, das häufig zur Bestimmung des P-gp-Hemmungspotenzials von Arzneimitteln verwendet wird33.

Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Rho123-Akkumulation zwischen den unbehandelten Kontrollzellen und den mit FZ behandelten Zellen festgestellt, was darauf hindeutet, dass keine Wechselwirkung zwischen FZ und P-gp besteht. (Abb. 2a,b) In Anwesenheit von Verapamil zeigten die behandelten und die unbehandelten Zellen vergleichbare Werte der Rho123-Akkumulation, was bestätigt, dass FZ weder ein Substrat noch ein Inhibitor von P-gp ist.

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