Il fenbendazolo agisce come un moderato agente destabilizzante dei microtubuli e provoca la morte delle cellule tumorali modulando più vie cellulari

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Lo studio è stato ricevuto: 26 aprile 2018 e accettato: 16 luglio 2018.
Pubblicato online: 09 agosto 2018

Nilambra Dogra1,2, Ashok Kumar1,3 & Tapas Mukhopadhyay1

1 – Centro nazionale per gli studi e la ricerca sul genoma umano, Panjab University, Sector-14, Chandigarh, 160014, India. 2 – Indirizzo attuale: Dipartimento di Medicina Sperimentale e Biotecnologie, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Sector-12, Chandigarh, 160012, India. 3 – Indirizzo attuale: Centre for Systems Biology and Bioinformatics, Panjab University, Sector-25, Chandigarh, 160014, India. La corrispondenza e le richieste di materiale vanno indirizzate a T.M. (e-mail: [email protected]).

I farmaci già approvati clinicamente o testati sperimentalmente per condizioni diverse dal cancro, ma che risultano possedere una citotossicità precedentemente non riconosciuta nei confronti delle cellule maligne, possono servire come candidati antitumorali adatti. Il metile N-(6-fenilsulfanil-1H benzimidazol-2-il) carbammato [Fenbendazolo, FZ], un composto benzimidazolico, è un farmaco antielmintico sicuro e poco costoso che possiede un’efficace attività antiproliferativa.

In un nostro precedente lavoro, abbiamo riportato una potente attività inibitoria della crescita di FZ causata in parte dalla compromissione della funzione proteasomica. Qui dimostriamo che l’FZ dimostra una moderata affinità per la tubulina di mammifero ed esercita citotossicità sulle cellule tumorali umane a concentrazioni micromolari. Contemporaneamente, ha provocato la traslocazione mitocondriale di p53 e ha inibito efficacemente l’assorbimento del glucosio, l’espressione dei trasportatori GLUT e l’esochinasi (HK II), un enzima glicolitico chiave di cui si nutre la maggior parte delle cellule tumorali. Il farmaco ha bloccato la crescita di xenotrapianti umani nel modello di topi nu/nu quando i topi sono stati nutriti con il farmaco per via orale.

I risultati, insieme ai nostri dati precedenti, suggeriscono che l’FZ è un nuovo agente che interferisce con i microtubuli e che mostra un’attività anti-neoplastica e può essere valutato come potenziale agente terapeutico grazie al suo effetto su molteplici vie cellulari che portano a un’efficace eliminazione delle cellule tumorali.

L’importanza dei microtubuli nella divisione cellulare, nella motilità, nel traffico intracellulare e il loro ruolo nella modulazione della forma cellulare in base all’ambiente li ha resi uno dei bersagli di maggior successo della terapia antitumorale. Gli agenti che perturbano la dinamica dei microtubuli sono stati ampiamente utilizzati nel trattamento dei tumori1-4. Considerando il relativo successo degli agenti mitotici nel trattamento del cancro, i microtubuli possono essere definiti come uno dei migliori bersagli antitumorali identificati finora5.

Gli agenti mirati ai microtubuli possono essere ampiamente classificati in due classi principali. La prima classe è costituita da agenti stabilizzanti dei microtubuli, che inibiscono la polimerizzazione dei microtubuli. Questa classe di farmaci antimitotici comprende diversi composti come gli alcaloidi della vinca (vinblastina, vincristina, vinorelbina, vindesina, vinflunina), l’estramustina, la colchicina e le combretastatine, che vengono utilizzati clinicamente o sono in fase di studio clinico per il trattamento del cancro. La seconda classe comprende gli agenti stabilizzatori dei microtubuli. Questi agenti includono paclitaxel, docetaxel, epotiloni e discodermolide6.
La conseguenza dell’interruzione della dinamica della tubulina e dei microtubuli con entrambe queste classi di farmaci nelle cellule in divisione è l’arresto in metafase e l’induzione dell’apoptosi.

Il fenbendazolo (metile N-(6-fenilsulfanil-1H-benzimidazol-2-il) carbammato) è un antielmintico benzimidazolico ad ampio spettro approvato per l’uso in numerose specie animali7. La riproposizione di farmaci veterinari che mostrano risultati promettenti per l’uso umano può comportare una notevole riduzione dei tempi e dei costi necessari per lo sviluppo di nuovi farmaci. Il fenbendazolo è noto per avere un elevato margine di sicurezza e la maggior parte delle specie lo tollera molto bene. Ha un grado di tossicità molto basso e un elevato grado di sicurezza negli animali da esperimento8-12.

In questo studio, abbiamo dimostrato che il fenbendazolo FZ) presenta una moderata attività depolimerizzante dei microtubuli nei confronti delle cellule tumorali umane, ma possiede un potente effetto antitumorale, come risulta da esperimenti in vitro e in vivo. I nostri risultati indicano che l’FZ esercita il suo effetto antitumorale attraverso l’interruzione della dinamica dei microtubuli, l’attivazione di p53 e la modulazione di geni coinvolti in molteplici vie cellulari. Il trattamento con FZ ha anche provocato una riduzione dell’assorbimento di glucosio nelle cellule tumorali, a causa di una regolazione negativa dei trasportatori GLUT e degli enzimi glicolitici chiave.

Poiché il processo di tumorigenesi coinvolge una serie di geni e proteine che alterano varie vie di segnalazione cellulare, i farmaci a bersaglio singolo mostrano un’efficacia limitata e possono portare alla resistenza ai farmaci13-15 . Gli agenti con bersagli cellulari multipli, quindi, dovrebbero avere un’efficacia migliore, oltre alla capacità di aggirare la probabilità di sviluppare resistenza. Nel complesso, il presente lavoro dimostra un effetto pleiotropico di FZ sulle cellule tumorali che porta alla morte cellulare. Pertanto, l’FZ può avere un potenziale terapeutico.

Risultati
La FZ destabilizza la rete tubulinica nelle cellule NSCLC umane.

È stato riportato che i carbammati benzimidazolici inibiscono la polimerizzazione della tubulina e interrompono la funzione dei microtubuli nelle cellule dei parassiti16,17. I risultati di studi in vitro condotti utilizzando estratti arricchiti di tubulina elmintica e di mammifero hanno suggerito che la tubulina è il bersaglio molecolare primario dei benzimidazoli18.

Pertanto, per esaminare l’effetto della FZ sull’organizzazione della rete di microtubuli nei mammiferi, le cellule di carcinoma polmonare umano non a piccole cellule (NSCLC) A549 sono state trattate con 1 uM di FZ per 24 ore e sottoposte a immunofluorescenza con l’anticorpo α-tubulina. La colchicina è stata utilizzata come controllo positivo. I risultati hanno mostrato che il trattamento con FZ ha causato una parziale alterazione della rete di microtubuli (Fig. 1a). La gabbia di microtubuli intorno al nucleo sembrava aver perso la sua integrità rispetto alle cellule di controllo trattate con mock. Tuttavia, questa modifica dell’organizzazione non era così marcata come nel caso del trattamento con colchicina, che ha mostrato una completa depolimerizzazione dei microtubuli in subunità di tubulina. Questi dati suggeriscono che la FZ provoca una distorsione della struttura microtubulare delle cellule.

L’effetto della FZ sulla polimerizzazione della tubulina è stato ulteriormente valutato con un saggio in vitro. La tubulina bovina purificata è stata incubata con FZ e la polimerizzazione della tubulina è stata registrata nel tempo. I risultati hanno mostrato una lieve inibizione della polimerizzazione della tubulina da parte della FZ in vitro, non così pronunciata come nel caso del trattamento con colchicina. (Fig. 1b)

Successivamente, l’effetto della FZ sulla polimerizzazione della tubulina è stato confrontato con quello di altri agenti destabilizzanti dei microtubuli come il nocodazolo e la colchicina. Le frazioni polimerizzate e solubili sono state preparate dopo 24 ore di trattamento farmacologico e il western blot è stato eseguito utilizzando gli anticorpi α-tubulina e β-actina (Fig. 1c). Le bande di tubulina delle frazioni polimerizzate e solubili sono state quantificate dopo la normalizzazione con le rispettive bande di β-actina, che sono servite come controllo interno (Fig. 1d).

Nelle cellule trattate con FZ si è registrata una modesta diminuzione della tubulina polimerica rispetto alle cellule di controllo non trattate, mentre la forma polimerica della tubulina era quasi assente nelle cellule trattate con colchicina. Il risultato conferma l’attività depolimerizzante della tubulina relativamente blanda dell’FZ rispetto ad altri agenti noti di disgregazione dei microtubuli come il nocodazolo e la colchicina.

Uno dei principali fattori limitanti dei taxani e degli alcaloidi della vinca è la loro tossicità a dose limitata e la suscettibilità alla resistenza multifarmaco (MDR) che si verifica comunemente a causa dell’elevata espressione della p-glicoproteina (p-gp; MDR1)19,20. Anche la sovraespressione delle isoforme di β-tubulina e le mutazioni sono note per conferire resistenza ai taxani21.

A differenza dei taxani e degli alcaloidi della vinca, gli agenti che hanno come bersaglio il sito di legame della colchicina presentano il vantaggio di mostrare una minima resistenza ai farmaci multipli, oltre alla capacità di superare l’effetto della sovraespressione delle isoforme della β-tubulina22-24. Tuttavia, l’inconveniente principale della colchicina e dei suoi derivati è la loro tossicità acuta per l’uomo22,25. Pertanto, un inibitore dei microtubuli che si leghi al sito di legame della colchicina ma che abbia una bassa tossicità può essere altamente efficace26,27. Il risultato di un saggio di legame competitivo con la colchicina basato sulla fluorescenza suggerisce che FZ può legarsi alla tubulina nel sito di legame della colchicina (Fig. S1).

L’acetilazione della tubulina è stata associata alla stabilità dei microtubuli. Pertanto, per esaminare lo stato di acetilazione della tubulina in seguito al trattamento, le cellule NSCLC umane sono state trattate con diversi agenti di targeting dei microtubuli per 24 ore e gli estratti cellulari sono stati sottoposti ad analisi western blot utilizzando l’anticorpo specifico Ac-α-tubulina (6-11B-1). Come mostrato nella Fig. 1e, mentre il nocodazolo, la colchicina e la vincristina hanno determinato una marcata riduzione della tubulina acetilata, la FZ non ha alterato la quantità di tubulina acetilata rispetto alle cellule di controllo trattate con mock. Questo risultato ha ulteriormente confermato l’effetto relativamente blando dell’FZ sulla tubulina dei mammiferi rispetto ad altri agenti depolimerizzanti dei microtubuli noti.

Figura 1. Il trattamento con FZ altera la rete tubulinica delle cellule tumorali umane. (a) Le cellule A549 sono state trattate con 1 uM FZ o 50 ng/ml colchicina per 24 ore. Dopo il trattamento, le cellule sono state processate per l’immunofluorescenza utilizzando anticorpi primari anti α-tubulina e secondari coniugati con FITC. (I nuclei sono stati controcolorati con ioduro di propidio) (b) La tubulina bovina (1,8 mg/mL) è stata incubata con DMSO (controllo), FZ (10 uM) o colchicina (100 nM) e l’effetto sulla polimerizzazione è stato monitorato spettrofotometricamente misurando la torbidità a 340 nm come descritto in “Metodi”. (c) Le cellule sono state trattate con FZ, nocodazolo, taxolo o colchicina per 24 ore, quindi lisate e frazionate in estratti solubili (S) e polimerizzati (P). Gli estratti sono stati separati con SDS-PAGE, trasferiti su membrane PVDF e testati con anticorpi anti-α-tubulina e anti-β-actina. È mostrata un’analisi rappresentativa dell’immunoblot in cellule A549. (d) L’intensità di ciascuna banda dell’immunoblot è stata misurata con il programma NIH ImageJ e sono stati calcolati i rapporti tra tubulina solubile e polimerizzata e β-actina in ciascun trattamento. (e) Le cellule sono state trattate con diversi MTA come indicato per 24 ore e il western blotting è stato poi eseguito utilizzando anticorpi specifici per Ac-α-tubulina (6-11B-1) e β-actina. (I blot a lunghezza intera e non ritagliati sono inclusi nella Fig. S6 supplementare).

FZ non è un substrato o un inibitore della P-gp.

Lo sviluppo della resistenza ai farmaci è una delle principali preoccupazioni nel trattamento del cancro. La resistenza multifarmaco (MDR), causata dalla sovraespressione del gene MDR-1 che codifica la P-glicoproteina (P-gp), è un meccanismo critico di resistenza ai farmaci che comporta una resistenza incrociata a più classi di farmaci28,29.

Un gran numero di farmaci chemioterapici comunemente utilizzati, come i taxani e gli alcaloidi della vinca, sono substrati della P-gp30.

Tuttavia, gli sforzi per inibire la P-gp non hanno mostrato risultati incoraggianti a causa degli inevitabili effetti collaterali31,32. Pertanto, la scoperta e lo sviluppo di nuovi composti antiproliferativi che non sono substrati della P-gp è un approccio efficace per superare la resistenza ai farmaci. Per verificare se FZ sia un substrato o un inibitore della P-gp, abbiamo studiato l’inibizione della crescita delle cellule tumorali da parte di FZ in presenza dell’inibitore della P-gp verapamil. I risultati hanno mostrato che l’inibizione della P-gp da parte del verapamil non ha potenziato l’effetto inibitorio della FZ sulla proliferazione delle cellule tumorali (Fig. 2c). Il colorante fluorescente rodamina 123 (Rho123) è un noto substrato di riferimento della P-gp, spesso utilizzato per determinare il potenziale inibitorio della P-gp dei farmaci33.

Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell’accumulo di Rho123 tra le cellule di controllo non trattate e quelle trattate con FZ, il che implica l’assenza di qualsiasi interazione di FZ con la P-gp. (Fig. 2a,b) In presenza di verapamil, le cellule trattate e non trattate hanno mostrato livelli comparabili di accumulo di Rho123, affermando che FZ non è un substrato o un inibitore della P-gp.

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