Studien har mottagits: 26 april 2018 och accepterad: 16 juli 2018.
Publicerad online: 09 augusti 2018
Nilambra Dogra1,2, Ashok Kumar1,3 & Tapas Mukhopadhyay1
1 – National Centre for Human Genome Studies and Research, Panjab University, Sector-14, Chandigarh, 160014, India. 2 – Present address: Department of Experimental Medicine and Biotechnology, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Sector-12, Chandigarh, 160012, India. 3 – Present address: Centre for Systems Biology and Bioinformatics, Panjab University, Sector-25, Chandigarh, 160014, India. Correspondence and requests for materials should be addressed to T.M. (email: [email protected])
Läkemedel som redan är kliniskt godkända eller experimentellt testade för andra tillstånd än cancer, men som visar sig ha en tidigare okänd cytotoxicitet mot maligna celler, kan fungera som lämpliga anticancerkandidater. Metyl-N-(6-fenylsulfanyl-1H-bensimidazol-2-yl)karbamat [Fenbendazol, FZ], en bensimidazolförening, är ett säkert och billigt anthelmintiskt läkemedel som har en effektiv antiproliferativ aktivitet.
I vårt tidigare arbete rapporterade vi en kraftigt tillväxthämmande aktivitet hos FZ som delvis orsakades av en försämring av proteasomfunktionen. Här visar vi att FZ uppvisar måttlig affinitet för tubulin från däggdjur och utövar cytotoxicitet mot humana cancerceller vid mikromolära koncentrationer. Samtidigt orsakade det mitokondriell translokation av p53 och hämmade effektivt glukosupptag, uttryck av GLUT-transportörer samt hexokinas (HK II) – ett viktigt glykolytiskt enzym som de flesta cancerceller trivs med. Det blockerade tillväxten av humana xenografts i nu/nu-musmodellen när mössen matades med läkemedlet oralt.
Resultaten, i kombination med våra tidigare data, tyder på att FZ är en ny mikrotubulistörande substans som uppvisar antineoplastisk aktivitet och kan utvärderas som en potentiell terapeutisk substans på grund av dess effekt på flera cellulära vägar som leder till effektiv eliminering av cancerceller.
Mikrotubulernas betydelse för celldelning, motilitet, intracellulär trafficking och deras roll för att modulera cellens form efter omgivningen har gjort dem till ett av de mest framgångsrika målen för cancerbehandling. Substanser som stör mikrotubulernas dynamik har använts i stor utsträckning vid cancerbehandling1-4. Med tanke på den relativa framgången för mitotiska substanser vid behandling av cancer, kan mikrotubuli anses vara ett av de bästa cancermål som hittills identifierats5.
Mikrotubuliinriktade medel kan i stort sett klassificeras i två huvudklasser. Den första klassen består av mikrotubuli-destabiliserande medel, som hämmar mikrotubuli-polymerisering. Denna klass av antimitotiska läkemedel omfattar flera föreningar, såsom vinkaalkaloider (vinblastin, vinkristin, vinorelbin, vindesin, vinflunin), estramustin, kolchicin och combretastatiner, som används kliniskt eller är under klinisk prövning för cancerbehandling. Den andra klassen består av mikrotubuli-stabiliserande medel. Dessa medel inkluderar paklitaxel, docetaxel, epothiloner och discodermolid.6.
Konsekvensen av att störa tubulin- och mikrotubulidynamiken med båda dessa läkemedelsklasser i delande celler är metafasstopp och inducering av apoptos.
Fenbendazol (metyl-N-(6-fenylsulfanyl-1H-bensimidazol-2-yl)karbamat) är ett bredspektrumbensimidazol anthelminthikum som godkänts för användning på många djurarter7. Återanvändning av veterinärmedicinska läkemedel med lovande resultat för användning på människor kan leda till avsevärda tids- och kostnadsbesparingar när det gäller att utveckla nya läkemedel. Fenbendazol är känt för att ha en hög säkerhetsmarginal och de flesta arter tolererar det mycket väl. Det har mycket låg grad av toxicitet och hög grad av säkerhet i försöksdjur8-12.
I denna studie visar vi att fenbendazol (FZ) uppvisar en måttlig depolymeriserande aktivitet av mikrotubuli i mänskliga cancerceller, men har en potent antitumöreffekt, vilket framgår av in vitro- och in vivo-experiment. Våra resultat tyder på att FZ utövar sin antitumöreffekt genom störning av mikrotubulidynamiken, aktivering av p53 och modulering av gener som är involverade i flera cellulära vägar. FZ-behandling resulterade också i minskat glukosupptag i cancerceller på grund av nedreglering av GLUT-transportörer och viktiga glykolytiska enzymer.
Eftersom tumörutvecklingsprocessen involverar ett antal gener och proteiner som förändrar olika cellsignalvägar, har läkemedel som är inriktade på en enda målgrupp begränsad effekt och kan leda till läkemedelsresistens13–15. Medel som har flera cellulära mål förväntas därför ha förbättrad effekt förutom förmågan att kringgå sannolikheten för att utveckla resistens. Sammantaget visar detta arbete att FZ har en pleiotropisk effekt på cancerceller som leder till celldöd. FZ kan således ha en potentiell terapeutisk tillämpning.
Resultat av
FZ destabiliserar tubulinnätverket i humana NSCLC-celler. Benzimidazolkarbamater har rapporterats hämma tubulinpolymerisation och störa mikrotubulifunktionen i parasitceller16,17. Resultat från in vitro-studier med anrikade extrakt av tubulin från helminter och däggdjur har antytt att tubulin är det primära molekylära målet för bensimidazolerna18.
För att undersöka effekten av FZ på organisationen av mikrotubulnätverk hos däggdjur behandlades därför A549-celler från humant icke småcelligt lungkarcinom (NSCLC) med 1 uM FZ under 24 timmar och bearbetades för immunofluorescens med α-tubulinantikropp. Kolkicin användes som positiv kontroll. Resultaten visade att FZ-behandling orsakade en partiell förändring av mikrotubuli-nätverket (fig. 1a). Mikrotubuliburen runt kärnan verkade ha förlorat sin intakthet jämfört med de kontrollerade mockabehandlade cellerna. Denna förändring i organisationen var dock inte lika markant som vid kolkicinbehandling, som visade fullständig depolymerisering av mikrotubuli till tubulinsubenheter. Dessa data tyder på att FZ orsakar en förvrängd mikrotubulistruktur i cellerna.
Effekten av FZ på tubulinpolymerisation utvärderades ytterligare genom en in vitro-analys. Renat bovint tubulin inkuberades med FZ och tubulinpolymerisation registrerades över tid. Resultaten visade en mild hämning av tubulinpolymerisation av FZ in vitro, vilken inte var lika uttalad som vid behandling med kolkicin. (Fig. 1b)
Därefter jämfördes effekten av FZ på tubulinpolymerisation med effekten av andra destabiliserande medel för mikrotubuli, såsom nocodazol och kolkicin. Polymeriserade och lösliga fraktioner bereddes efter 24 timmars läkemedelsbehandling och western blot utfördes med antikroppar mot α-tubulin och β-aktin (fig. 1c). Tubulinbanden i polymeriserade och lösliga fraktioner kvantifierades efter normalisering med deras respektive β-aktinband som fungerade som en intern kontroll (fig. 1d).
Det skedde en blygsam minskning av polymert tubulin i FZ-behandlade celler jämfört med obehandlade kontrollceller, medan den polymeriserade formen av tubulin nästan saknades i kolkicinbehandlade celler. Resultatet bekräftar FZ:s relativt milda depolymeriserande aktivitet på tubulin jämfört med andra kända mikrotubulistörande medel som nocodazol och kolkicin.En viktig begränsande faktor för taxaner och vinkaalkaloider är deras dosbegränsande toxicitet och känslighet för multiresistens mot läkemedel (MDR), vilket ofta beror på det höga uttrycket av p-glykoprotein (p-gp; MDR1)19,20. Överexpression av β-tubulinisoformer och mutationer är också kända för att ge resistens mot taxaner21.Till skillnad från taxaner och vinkaalkaloider har substanser som är inriktade på bindningsstället för kolkicin den fördelen att de uppvisar minimal multiresistens och dessutom kan övervinna effekten av överuttryck av β-tubulinisoformer22–24. Den största nackdelen med kolkicin och dess derivat är dock deras akuta toxicitet för människor22,25. Därför kan en mikrotubulihämmare som binder till kolkicinets bindningsställe men har låg toxicitet vara mycket effektiv26,27. Resultatet av en fluorescensbaserad kompetitiv kolkicinbindningsanalys tyder på att FZ kan binda till tubulinet vid kolkicinbindningsstället (fig. S1).
Acetylering av tubulin har förknippats med stabiliteten hos mikrotubuli. För att undersöka tubulinets acetyleringsstatus efter behandling behandlades därför humana NSCLC-celler med olika mikrotubuliinriktade medel under 24 timmar och cellextrakten utsattes för western blot-analys med Ac-α-tubulin-specifik antikropp (6-11B-1). Som visas i fig. 1e, medan nocodazol, kolkicin och vinkristin resulterade i en markant minskning av acetylerat tubulin, förändrade FZ inte mängden acetylerat tubulin jämfört med kontrollceller som behandlats med mock. Detta resultat bekräftade ytterligare den relativt milda effekten av FZ på tubulin från däggdjur jämfört med andra kända depolymeriserande medel för mikrotubuli.
Figur 1. FZ-behandling förändrar tubulinnätverket i mänskliga cancerceller. (a) A549-celler behandlades med 1 uM FZ eller 50 ng/ml kolkicin i 24 h. Efter behandlingen bearbetades cellerna för immunofluorescens med primära antikroppar mot α-tubulin och FITC-konjugerade sekundära antikroppar. (Kärnorna motfärgades med propidiumjodid) (b) bovint tubulin (1,8 mg/ml) inkuberades med DMSO (kontroll), FZ (10 uM) eller kolkicin (100 nM) och effekten på polymeriseringen övervakades spektrofotometriskt genom mätning av turbiditet vid 340 nm enligt beskrivningen i ”Metoder”. (c) Cellerna behandlades med FZ, nocodazol, taxol eller kolkicin i 24 timmar och lyserades sedan och fraktionerades i lösliga (S) och polymeriserade (P) extrakt. Extrakten separerades med SDS-PAGE, överfördes till PVDF-membran och undersöktes med antikroppar mot både anti-α-tubulin och anti-β-aktin. En representativ immunoblotanalys i A549-celler visas. (d) Intensiteten för varje band i immunoblot mättes med NIH ImageJ-programmet, och förhållandet mellan lösligt och polymeriserat tubulin och β-aktin i varje behandling beräknades. (e) Cellerna behandlades med olika MTA enligt anvisningarna i 24 timmar och western blotting utfördes sedan med Ac-α-tubulin (6-11B-1) specifika antikroppar och β-aktin-antikroppar. (Fullängdsblottor utan beskärning ingår i kompletterande figur S6).
FZ är inte ett P-gp substrat eller hämmare. Utveckling av läkemedelsresistens är ett stort problem inom cancerbehandling. Multidrugresistens (MDR) som orsakas av överuttryck av MDR-1-genen som kodar för P-glykoprotein (P-gp) är en kritisk mekanism för läkemedelsresistens som leder till korsresistens mot flera klasser av läkemedel28,29. Ett stort antal vanliga kemoterapiläkemedel som taxaner och vinkaalkaloider är P-gp-substrat30.
Försök att hämma P-gp har dock inte visat några uppmuntrande resultat på grund av oundvikliga biverkningar31,32. Därför är upptäckt och utveckling av nya antiproliferativa föreningar som inte är substrat för P-gp en effektiv metod för att övervinna läkemedelsresistens. För att testa om FZ är ett substrat eller en hämmare av P-gp undersökte vi hämning av cancercellstillväxt med FZ i närvaro av P-gp-hämmaren verapamil. Resultaten visade att verapamils hämning av P-gp inte förstärkte FZ:s hämmande effekt på cancercellernas proliferation (fig. 2c). Det fluorescerande färgämnet rhodamine 123 (Rho123) är ett välkänt referenssubstrat för P-gp som ofta används för att bestämma den P-gp-hämmande potentialen hos läkemedel33.
Ingen signifikant skillnad i Rho123-ackumulering observerades mellan obehandlade kontrollceller och FZ-behandlade celler, vilket tyder på att FZ inte interagerar med P-gp. (Fig. 2a,b) I närvaro av verapamil uppvisade de behandlade och obehandlade cellerna jämförbara nivåer av Rho123-ackumulering, vilket bekräftar att FZ inte är ett substrat eller en hämmare av P-gp.